Schlussbericht „binding of cocaine to melanine“

Stephan Utzinger, Novartis Pharma AG, Basel Schlussbericht „binding of cocaine to melanine“

Einleitung

Melanin ist der Oberbegriff für eine Gruppe von Pigmenten unterschiedlichen
Ursprungs (Bakterien, Pflanzen, Pilze, Tiere und Mensch) aber gleichen
Eigenschaften. Dazu gehört z.B. die Unlöslichkeit in Wasser oder organischen
Lösungsmitteln. Melanine sind Makromoleküle, die durch oxidative Polymerisation
von phenol oder indolhaltigen Komponenten entstanden sind. Aufgrund der
physikalischen Eigenschaften ist die Untersuchung der Bindung von Substanzen an
Melanin nicht einfach.
In der Entwicklung von Medikamenten ist die Bindung von Substanzen wie Kokain an
Melanin relevant, da je nach Bindungsstärke erwünschte, aber auch toxische Effekte
auftreten können. Je stärker eine Substanz an Melanin bindet, desto länger verbleibt
der Stoff im Organismus.
In einem weiteren Schritt wird Kokain mit HLM (human liver microsomes) verdaut.
Somit entstehen Metaboliten. Nun ist die Frage, wie stark die Metaboliten von Kokain
an Melanin binden. Dies ist wichtig zu wissen, da die Metaboliten durch eine stärkere
Melaninbindung als Kokain länger im Körper verbleiben würden. Durch toxische
Eigenschaften von Metaboliten können dadurch unerwünschte Nebenwirkungen
auftreten.
Methodik

Melanin Synthese
Zur Melanin Synthese werden 800mg L-Dopa (3,4 Dihydroxy-L-phenylalanine) in
800ml eines 67mM Natriumphosphatpuffers mit pH 8 gelöst. Die Lösung wird bei
Raumtemperatur während 4 Tagen gerührt. Bereits nach kurzer Zeit färbt sich die
Lösung dunkel. Der Polymerisationsprozess ist beendet, wenn eine konstante UV
Absorption der Reaktionslösung bei 405nm beobachtet werden kann, was nach etwa
vier Tagen der Fall ist. Danach wird die Lösung während 30 min bei 5000xg
zentrifugiert, der Überstand dekantiert und das Pellet in 10ml PBST resuspendiert.
Zur Ermittlung der Melaninkonzentration werden drei Mal 0.2ml der Suspension
10min bei 30000xg zentrifugiert. Danach wird der Überstand verworfen und das
Melanin während 20min bei 95°C getrocknet. Anschliessend wird das Melanin
gewogen und der Melaningehalt der Suspension berechnet.
Messung der Bindung von Kokain an Melanin
Nachdem das Melanin synthetisiert ist, wird es auf 0.2mg/ml verdünnt. Nun werden
verschiedene Konzentrationen (50µM bis 0.4µM) des Kokains der Melaninlösung
beigefügt. Während einer Stunde wird die Lösung bei 25°C und 1000rpm inkubiert.
Stephan Utzinger, Novartis Pharma AG, Basel Während dieser Zeit bindet das Kokain an das Melanin. Nach der Inkubation wird die Lösung währen 10min bei 30000xg zentrifugiert. Der Überstand wird mittels HPLC quantitativ analysiert. Das Kokain wird bei einer bestimmten Retentionszeit von der apolaren (reversed phase) Säule mit einem Gradienten von Wasser nach Acetonitril eluiert und bei einer Wellenlänge von 254 nm detektiert. Mit den erhaltenen Konzentrationen können die Bindungsparameter Kd und Bmax berechnet werden. Es bestehen zwei Möglichkeiten zur Berechnung der Bindungsaffinität: Sigma Plot (one site binding) und das Langmuir Modell (multiple site). SigmaPlot Bei diesem Modell gibt es keine Einteilung der Messpunkte. Es ist ein Modell für eine Art von Bindungsstellen mit den gleichen Eigenschaften. Hier entspricht Bmax dem Grenzwert der Kurve und Kd der x-Koordinate des halben y-Wertes von Bmax. Die x-Achse entspricht der Konzentration der Verdünnungsreihe und die y-Achse der gebundenen nmol pro mg. Die Parameter werden mithilfe der Software SigmaPlot berechnet. Langmuir-Modell Bei der Langmuir-Regression gibt es eine Einteilung der Messpunkte in schwache und starke Bindungsstellen. Die Messpunkte derselben Kategorie liegen jeweils ungefähr auf einer Geraden. Die Punkte mit den tieferen y-Werten gelten als die starken Bindungsstellen und diejenigen mit den hohen y-Werten als schwache Bindungsstellen. In der Grafik entspricht die x-Achse der Konzentration des ungebundenen Stoffanteils in nmol pro Liter und die y-Achse dem Quotient der Konzentration des ungebundenen Stoffanteils in nmol/Liter und der Konzentration des gebundenen Stoffanteils in nmol/mg. Die Bindungsparameter werden hier mit einer Linearen Regression mit den entsprechenden Datenpunkten berechnet. Wobei Bmax = 1/Steigung und Kd = Achsenabschnitt * Bmax. Löslichkeit und Bindung an die Gefässwand Eine Unlöslichkeit der Testsubstanz Kokain oder eine Bindung an das Gefäss würde die Resultate verfälschen. Deshalb wird ein Löslichkeitstest durchgeführt. Lösungen von allen Konzentrationen der Testsubstanz bei den entsprechenden Konzentrationen werden für 10 Minuten bei 30000xg zentrifugiert. Die Überstande werden mittels HPLC analysiert. Der Quotient von Fläche/Konzentration der Testsubstanz aufgetragen gegen die nominale Konzentration sollte eine horizontale Linie ergeben. Abweichungen von der horizontalen Linie durch Unlöslichkeit im oberen Konzentrationsbereich oder Bindung an die Gefässwand im unteren Konzentrationsbereich können so sichtbar gemacht werden. Verdauung von Kokain mittels HLM Kokain wird mit HLM in einer 3 mL Lösung metabolisiert. Dazu inkubiert man Kokain (20 µmol/L) in einem Puffer von 100 mmol/L Kaliumphosphat pH 7.4, 5 mmol/L Magnesiumchlorid für zwei Stunden bei 37°C mit HLM von einer totale Proteinkonzentration von 1 mg/mL und 1 mmol/L NADPH als Kofaktor. Nach der Inkubation wird mit 4 mL Acetonitril für eine halbe Stunde bei -20°C die Reaktion gefällt. Die Präzipitate werden durch eine Zentrifugation bei 30‘000xg und 15 Minuten abgetrennt. Nach Evaporation des Lösungsmittels für 15 Minuten bei 40°C und Stephan Utzinger, Novartis Pharma AG, Basel
Stickstoff Begasung wird der Ueberstand weiter mit einer Festphasen Extraktion (96
well Format) aufgereiningt. Schliesslich werden die Metaboliten in 500 µL Wasser
ersuspendiert.
Messung der Bindung von Metaboliten an Melanin
Die in Wasser gelösten Metaboliten werden nun mit verschiedenen Konzentrationen
von Melanin inkubiert. Die Konzentrationen des Melanins betragen 0.1mg/ml,
0.05mg/ml und 0.025mg/ml. Die Lösung wird während einer Stunde bei 25°C und
1000rpm im Thermomixer inkubiert. Anschliessend wird 10min bei 30000xg
zentrifugiert und der Überstand mittels HPLC analysiert.
Resultate
Mindestens zwei Messpunkte sollten sich unter-bzw. oberhalb von 50% befinden
(50% Regel). Alle Punkte lagen hier über 50%. Aus Zeitgründen verwendete man die
erhaltenen Daten zur Berechnung der Parameter. Für die Berechnung verwendete
man die Messpunkte von 0.4 bis 25 µmol/L.
Bindungskurve: Cocaine / 0.2 mg/ml Melanin
Stephan Utzinger, Novartis Pharma AG, Basel Auswertung mit SigmaPlot (Model für eine
Bindungsstelle): Cocaine / 0.2 mg/ml Melanin
Parameter
StdErr CV(%) Dependencies
Auswertung mit linearer Langmuir-Regression (Model
für mehere Bindungsstellen): Cocaine / 0.2 mg/ml
c(free)/bound 200
c(free) [nM]
Dort, wo die Steigung gross ist, befindet sich eine starke Bindung. Bmax1 und Kd1 bezeichnen die schwachen Bindungsstellen und wurden durch die Messpunkte zwischen 6-25 µmol/L berechnet. Bmax2 und Kd2 bezeichnen die starken Bindungsstellen und wurden durch die Messpunkte zwischen 0.4-3 µmol/L berechnet. Bmax1 Kd1
Bmax1/Kd1
Bmax2 Kd2 Bmax2/Kd2
Stephan Utzinger, Novartis Pharma AG, Basel Löslichkeitskurve: Cocaine
Fläche/Konzentra 10
Eine horizontale Linie zeigt, dass die Testsubstanz im gemessene Bereich löslich ist und nicht an die Gefässwand bindet. Dies ist das HPLC Chromatogramm von Kokain nach dem Verdau mit HLM. Stephan Utzinger, Novartis Pharma AG, Basel Dies ist das HPLC Chromatogramm von verdautem Kokain, das mit 0.1mg/ml
Melanin inkubiert wurde.

Diskussion
Mithilfe dieses Experiments wird gezeigt, dass Kokain mittelmässig an Melanin
bindet. Dadurch wird es länger im Körper bleiben, als Substanzen, die nur schwach
oder gar nicht an Melanin binden, aber weniger lang als Substanzen die stark an
Melanin binden, wie zum Beispiel Chloroquine (ein Anti-Malaria Medikament).
Die HPLC Analyse des Kokains zeigte, dass das verwendete Kokain nur 90% rein
war (UV254 nm), was eine genaue Analyse erschwerte. Wird das Kokain mit HLM
verdaut, so entstehen verschiedene Metaboliten. Dies ist ersichtlich, da zusätzliche
Peaks im Chromatogram erscheinen. Wird das verdaute Kokain zu Melanin gegeben,
kann man durch einen Vergleich der Abnahme der Peak Flächen erkennen, wie stark
die Metaboliten im Vergleich zu Kokain an Melanin binden. Allerdings müsste man
die Bindung bei gleichen Konzentrationen der Metaboliten und des Kokains
vergleichen. Eine genauere Analyse war aus Zeitgründen leider nicht möglich. Die
hier erhaltenen Resultate weisen darauf hin, dass keiner der gebildeten Metaboliten
stärker an Melanin bindet als Kokain.
Danksagung
Ganz herzlich möchte ich mich bei meinem Betreuer Stephan Utzinger bedanken,
der mir während einer Woche viele interessante Aspekte des Forschens in einem
grossen Pharmaunternehmen gezeigt hat. Mein Dank geht zudem an Peter End, der
das Projekt koordiniert hat und an die Novartis, die meine Studienwoche mitfinanziert
und ermöglicht hat. Herzlichst bedanke ich mich auch bei der Stiftung Schweizer
Jugend forscht, die diese Studienwoche organisierte. Dank Schweizer Jugend forscht
konnte ich überhaupt an dieser Studienwoche teilnehmen.

Source: http://www.sjf.ch/wp-content/uploads/2012/10/Binding-of-cocaine-to-melanine.pdf