Mikrobiologie kursablauf

Enzympraktikum

Name Schule Klasse Datum
1. Theorie - separates Dossier, im BioBuch unter Photosynthese, Zellatmung, Ernährung
I. Verstehen von enzymatischen Vorgängen. II. Verhalten im Labor und Einhalten der Laborregeln. 3. Material
3.1. Kompetitive Hemmung von Amylase durch das Medikament „Glucobay“
Labormaterial
Reagenzien
Geräte/Apparaturen
3.2. Synthese von Stärke in vitro
Labormaterial
Reagenzien/Organismen
Geräte/Apparaturen
2 Zentrifugen-Röhrchen mit Deckel
1 Test-Röhrchen ohne Deckel
Filzschreiber, Stoppuhr
3.3. Temperaturabhängigkeit der Enzymaktivität
Labormaterial
Reagenzien
Geräte/Apparaturen
0°C, 15°C, 25°C, 37°C, 45°C, 55°C, 75°C, 95°C Bitte Photokameras für die Dokumentation der Resultate selber mitbringen.

4. Durchführung
4.1. Kompetitive Hemmung von Amylase durch das Medikament "Glucobay"
Einleitung
Amylase ist ein Stärke abbauendes Enzym. Das Polysaccharid Stärke wird dabei über Dextrine und Oligosac-
charide von 6 bis 8 Glucoseeinheiten bis zum Disaccharid Maltose zerlegt.
Nachgewiesen werden kann die Wirkung von Amylase durch die Iodprobe oder die Fehlingprobe (Reduktion
von Cu+2, blau komplexiert bis Cu+1 rot, Fäl ung).
Glucobay enthält die Substanz Acarbose. Acarbose kann zur Therapie von Diabetes Typ II eingesetzt werden.
Die Acarbose hemmt die Amylase und verlangsamt damit den Abbau zur Maltose und damit den weiteren
Abbau zur Glucose, letztlich die Aufnahme von Glucose. Ein Teil der Stärke landet dann im Dickdarm, wo sich
Bakterien über sie heran machen. Die dabei entstehenden Gärgase sind al erdings nicht beliebt. Der Wirkstoff
Acarbose wird nicht in den Körper aufgenommen. Seine Wirkung hält vier bis sechs Stunden an. Acarbose hemmt auch die enzymatische Spaltung der Saccharose. Acarbose wird vom Bakterium Actinoplanes sp. exprimiert. In dem Bakterium erfül t die Acarbose zwei Auf-gaben: Als Inhibitor von maltolytischen Enzymen und Maltodextrin-Aufnahmesystemen werden Enzyme von Nahrungsmittelkonkurrenten ausgeschaltet und damit Selektionsvorteile erworben. Ausserdem kann der eigene Stärkeabbau reguliert werden. Acarbose wird heutzutage mit einem Grosstechnischen Prozess fer-mentativ hergestellt. Abb. 1: Glucobay
Die Acarbose ist ein Pseudotetraglucan, das unter anderem aus Maltose besteht, die mit einem anderen mo-difizierten Disaccharid verbunden ist. Der Stoff ist ein kompetitiver Hemmstoff, das heisst er konkurriert mit der Amylose (Stärke) als Substrat im aktiven Zentrum der Amylase. Abb. 2: Acarbose-Struktur

Durchführung der Arbeit
a) Eine Tablette Glucobay wird vermörsert und in 20 ml Wasser suspendiert. Jede Gruppe erhält davon 0,5
ml in einem blauen Mikrogefäss, diese Arbeit ist bereits vom Assistenten vorbereitet. b) Sechs Reagensgläser werden nummeriert. In jedes werden 5 ml Stärkelösung hineinpipettiert. c) In Reagenzglas 3 bis 6 gibt man in steigender Menge Acarbosesuspension (Glucobay) dazu (0.02 ml, 0.04 ml, 0.06 ml und 0.08 ml, Reagensgläser entsprechend anschreiben). d) Danach gibt man ins 2. bis 6. Reagenzglas schnel je 0.5 ml Amylaselösung dazu und mischt mit dem Vor- e) Die Reagenzgläser werden anschliessend 10 Minuten bei Rautemperatur stehen gelassen. f) Nun werden in jedes Reagenzglas ein Tropfen Iod-Kaliumiodidlösung gegeben und die Hydrolyse der
Für diese Aufgabe könnt ihr Euch an der folgenden Pipettiertabel e orientieren:
Tabelle 1: Pipettiertabelle für Aufgabe 1
Reagenzglas
4.2. In vitro Synthese von Stärke
Einleitung
Makromoleküle (grosse Moleküle) sind immer aus kleineren molekularen Bausteinen zusammengesetzt. Es
handelt sich bei Makromolekülen um Polymere aus einer oder mehreren Sorten von Monomeren (Einzelmo-
lekülen). Das Polymer Stärke ist typischerweise aus hunderten des Monomers Glukose aufgebaut.
In diesem Experiment arbeiten wir mit dem stärkefreien Saft von Kartoffeln, welcher verschiedene Enzyme
enthält. Darunter befinden sich, je nach biologischer Aktivität in der entstehenden, ruhenden oder keimenden
Knolle, mehr oder weniger Enzyme zum Auf- oder Abbau von Stärke.
Lies die Anleitung zum Experiment genau durch; kontrol iere, ob al es benötigte Material bereit steht. Schon
vor der Durchführung des Experiments muss der zeitliche Ablauf absolut klar sein.
Durchführung der Arbeit
a) Cut a piece of potato tissue, remove the skin, and grind about 2 cm3 of the white part with a little clean
sharp sand in a mortar to break open the potato cel s and to make a slurry mixture. Add 7 ml of tap water and mix wel again. b) Drain off 2 times 1.5 ml of the juice into a pair of centrifuge tubes, and spin them for 7 minutes until a 1 ml sample of the clear liquid gives no blue-black colour when tested separately with iodine solution in a test tube. c) Meanwhile, use a pipette to place 100 microliter portions of a 1 per cent solution of glucose-1-phosphate in the top and bottom rows of depressions on a white tile (rows A and C in the figure). Put 100 microliter portions of water in the depressions of rows B and C. d) Note the time by the clock and then put 100 microliter portions of the centrifuged potato extract (now free from starch) into al the depressions of rows A and B. e) Wait one minute: then add single drops of iodine solution to the first column of drops (rows A, B, and C: time 1 min). Note any colours produced when the tile is gently rocked to mix the solutions. Do not stir the mixtures in order not to transfer liquid from one to the next. f) After four minutes, repeat the addition of iodine solution, but this time to the second column (rows A, B, and C: time 4 min), recording the colours as before. g) Repeat the experiment after seven and ten minutes respectively. Abb. 3: Experimental overview

3. Temperaturabhängigkeit der Enzymaktivität
Durchführung der Arbeit
a) Acht Reagenzgläser werden mit den Temperaturen 0°C, 15°C, 25°C, 37°C, 45°C, 55°C, 75°C und 95°C ange-
b) In al e Reagensgläser werden 5 ml Stärkelösung hineinpipettiert. Diese werden nun für die gesamte Expe- rimentdauer in die entsprechenden Temperaturbäder gestel t. c) Nach 5 Minuten im jeweiligen Wasserbad werden in Abständen von 20 Sekunden nacheinander in jedes Reagenzglas 0.25 ml Spucke (Amylaselösung) hineinpipettiert. d) Nach 7 min. Inkubationszeit (Einwirkzeit) werden abermals in jedes Reagenzglas, ebenfal s in Abständen von 20 Sekunden, zwei Tropfen Iod-Kaliumiodidlösung hineingegeben, erst jetzt die Gläschen wieder aus den Bädern nehmen und die Resultate protokol ieren.
Hinweis: Da es in diesem Praktikum viel zu tun gibt, muss von allen Gruppen ein Zeitplan zu Hause
schriftlich angefertigt und zu Beginn des Praktikums der Lehrkraft gezeigt werden. Die Aufgaben können
innerhalb der Zweiergruppe aufgeteilt werden.
Zeitplan
Zu einem vol ständigen Praktikumsbericht gehören auch die nachfolgenden Punkte. Ergänze diese Vorlage
mit weiteren Seiten. Klebe deine Fotos an den entsprechenden Stel en ein und schreibe zu jedem Punkt einen
kurzen Kommentar.
5. Resultate
6. Auswertung
7. Interpretation
8. Zusammenfassung
9. Quellen
0.9.2012

Source: http://www.kantiwil.ch/uploads/media/002_Enzympraktikum_Labor.pdf